Aislamien= to e identificación de microorganismos con interés agroindustrial a partir de muestras de suelo de bosques primarios del cantón Colta<= /span>

&nbs= p;

Isolation and identification of microorganisms with agro-industrial interest from soil samples from primary forests in Colta ci= ty

<= /p>

= ¹=

Alejan= dro Guillermo Orellana Quinchuela

<= /span>

https://orcid.org/0009-0003-3067-6765

Investigador independiente, Riobamba, Ecuador.

= ²=

María Verónica González Cabrera

https://orcid.org/0000-0002-5358-798X

<= /span>

Facultad de Ciencias Pecuarias, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo (ESPOCH= ), Riobamba, Ecuador.

mariav.gonzalez@espoch.edu.ec

= ³=

Carmen Alicia Zavala Tocano=

https://orcid.org/0000-0003-0720-3479

<= /span>

Facultad de Ciencias Pecuarias, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo (ESPOCH= ), Riobamba, Ecuador.

alicia.zaval@espoch.edu.ec

= ⁴=

Gabrie= la Margarita Vayas Castillo

https://orcid.org/0000-0001-5402-740X

<= /span>

Ciencias Pecuarias, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo (ESPOCH), Riobamba, Ecuador.

gabriela.vayas@espoch.edu.ec=

Artículo de Investigación Científica y Tecnológica

Enviado: 09/02/2023=

Revisado: 17/03/2023

Aceptado: 12/04/2023

Publicado:30/05/2023

DOI: https://doi.org/10.33262/concienciadigital.v6i2.1= .2563 <= /o:p>

=

Cítese:

Orellana Quinchuela, A. G., González Cabrera, M. V., Zavala Tocano, C. A., & Vayas Castillo, G. M. (2023). Aislamiento e identificación de microorganismos con interés agroindustrial a partir de muestras de suelo de bosques primarios del can= tón Colta. ConcienciaDigital, 6(2.1), 24-40. https://doi.org/10.33262/concienciadigital.v6i2.1.2563

CONCIENCIA DIGITAL, es una revista multidisciplinar, trimestral,<= /b> que se publicará en soporte electrónico tiene como misión contribu= ir a la formación de profesionales competentes con visión humaníst= ica y crítica que sean capaces de exponer sus resultados investigativos y científicos en la misma medida que se promueva mediante su intervención cambios positivos en la sociedad. https://concienciadigital.org

La revista es editada por la Editorial Ciencia Digital (Editorial de prestigio registrada en la Cámara Ecuatoriana de Li= bro con No de Afiliación 663) www.celibro.org.ec

=

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Palabras claves:=

Aerobio, Anaerobiosis, UFC, lactosa, fructuosa

Resumen =

Introducción: Los bosques primarios mantienen zonas vírgenes en las cuales existe mucha diversidad biológica aún desconocidas= . Objetivo: El presente estudio tiene la finalid= ad de aislar especies no conocidas de bacterias ácido-lácticas (BAL), levadu= ras fermentativas y bacterias aerobias fermentativas de suelos de bosques primarios, para verificar su potencial uso en la agroindustria. Metodología. para el caso= de bacterias ácido-lácticas se sembró a partir de las muestras de suelo del bosque primario de Cańi en medio ácido con MRS y anaerobiosis con = 13,3 x10^= 5 UFC/mL presentes a 3= 5°C, las especies aisladas degradaron la lactosa y acidificaron el sustrato. En las levaduras se sembró a partir de las muestras del suelo usando 12 x10^5 UFC/mL presentes, en medio YPD neutro con presencia de dextrosa en presen= cia de oxígeno y un inhibidor de crecimiento bacteriano a 30°C, luego se seleccionó las especies resistentes al alcohol al 8%, fermentaron la gluc= osa y fructuosa de buena manera menos la lactosa y se realizó una fermentació= n en jugo de cítricos por 45 días eliminando agentes patógenos y se obtuvo producción de etanol y CO₂.Las bacterias fermentativas se las sembró a partir de las muestras del suelo del bosque primario con 12 x10^5 UFC/mL presentes, en agar de GYC en condiciones aerobias a 30°C. Resultados. Se caracterizaron a los microorganismos especialmente bacterias ácido-láctic= as de las cuales sólo dos especies aisladas fermentaron la lactosa con mucha facilidad la C3R2 y la muestra C3R1 las cuales metabolizaron la lactosa m= uy rápido en las levaduras. La muestra 001 BC1 fue la que pudo generar mayor producción de gas y pasó la prueba del SH₂ con lo que no es no= civo para su uso para degradar biomasa, en bacterias fermentativas las muestras 009C2 y 007C1´ fueron las que sobrevivieron al alcohol y las que fermenta= ron de mejor manera y en la prueba de SH₂ se presentaron resultados negativos con lo cual también se puede inferir que no afecta al uso human= o, finalmente las levaduras aisladas luego de 45 días metabolizando el zumo = de los cítricos con la liberación de etanol siendo una fermentación de inter= és agroindustrial. <= b>Conclusión. Con este trabajo se obtienen bacterias ácido-lácticas aisladas de suelo de bosques primarios con capacidades fermentativas fren= te a la lactosa además de su posible aplicación para degradar biomasa, finalme= nte las levaduras aisladas metabolizan el zumo de los cítricos con la liberac= ión de etanol siendo una fermentación de interés agroindustrial. Ár= ea de estudio general: Agroindustria. Área de estudio específica: Microbiología Industrial.

&= nbsp;

Keywords:=

Aerobic, Anaerobic, CFU, lactose, fructose

Abstract<= /o:p>

Introduction: Primary forests maintain virgin areas in which there is much unknown biological diversity. Objective: The purpose of this study is to isolate unkn= own species of lactic acid bacteria (LAB), fermentative yeasts, and aerobic fermentative bacteria from primary forest soils, to verify their potential use in agroindustry. Methodology. In the case of lactic acid bacte= ria, soil samples from the primary forest of Cańi were planted in an acid medi= um with MRS and anaerobiosis with 13.3 x10^5 CFU/mL present at 35°C, the isolated species degraded the lactose and acidified the substrate. Yeasts were sown from soil samples using 12 x10^5 CFU/mL present, in a neutral Y= PD medium with the presence of dextrose in the presence of oxygen and a bacterial growth inhibitor at 30°C, then the species were selected. resis= tant to 8% alcohol, glucose and fructose fermented well except lactose and fermentation was conducted in citrus juice for 45 days, eliminating patho= gens and ethanol and CO2 production was obtained. Fermentative bacteria were planted from of primary forest soil samples with 12 x10^5 CFU/mL present,= on GYC agar under aerobic conditions at 30°C. Results. The microorganisms, especially lactic acid bacteria, of which only two isolat= ed species fermented lactose very easily, C3R2 and the sample C3R1, which metabolized lactose very quickly in yeasts, were characterized. Sample 001 BC1 was the one that could generate the greatest gas production and passed the SH2 test, which is not harmful for its use to degrade biomass. In fer= mentative bacteria, samples 009C2 and 007C1' were the ones that survived alcohol and those that they fermented in a better way and in the SH2 test negative results were presented, with which it can also be inferred that it does n= ot affect human use, finally the yeasts isolated after 45 days metabolizing = the citrus juice with the release of ethanol being a fermentation of agro-industrial interest. Conclusion. With this work, lactic acid bacteria isolated from the soil of primary forests with fermentative capa= cities against lactose are obtained, in addition to their application to degrade biomass. Finally, the isolated yeasts metabolize the citrus juice with the release of ethanol, being a fermentation of agro-industrial interest=

Introducción

La biodiversidad que se encuentra en los bosques primarios es muy rica tanto en especies animales como en especies vegetales= y ni hablar de las especies microbianas existentes es por esto que es un ecosistema considerado como uno de los más importantes y la vez frágiles según la evaluación de = los recursos forestales mundiales (FRA) dirigido por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, 20= 20)= , esta organización estima que ecosistemas del tipo bosques primarios corresponden= en la actualidad a un 30,8% de la superf= icie terrestre. Pero de la misma manera que más de la mitad de este porcentaje global se hallan distribuidos en cinco países: Rusia, Brasil, Estados Unido= s y China y además dos tercios de las tierras que pertenecen a los bosques primarios es decir aproximadamente un 66% le pertenecen a tan sólo 10 países por lo que se puede ver una disparidad en lo que se refiere la distribución= de áreas destinadas a salvaguardar la flora y fauna (Meena et al., 2017), y por consiguiente a la microflora que se encuentran en los suelos primarios (FAO, 20= 20)= .

Esta biodiversidad determina la importancia de los microorganismos presentes en = los suelos primarios (FAO, 2021), ya que la disponibilidad de nutrientes inorgánicos permite el desarrollo adecuado de infinidad de especies tales c= omo bacterias ácido-lácticas y levaduras cuyas funciones biológicas presentan interés para la industria de las fermentaciones y elaboración de alimentos funcionales como alternativas a los problemas de salud relacionados a los alimentos (Hoda et al. 2021).

Metodología

En la presente investigación se aplicó el método científico dando inicio al proce= so con la observación de la realidad, continuando con el planteamiento del problema, consideración del marco teórico y por último la formulación y verificación de la hipótesis. Al tener un desarrollo que va de lo general c= omo son teorías revisadas en tesis, revistas científicas y libros; a situaciones específicas o particulares como el aislamiento de las bacterias ácido-lácti= cas y levaduras presentes en el suelo del bosque primario a través de un anális= is microbiológico exhaustivo

De igual manera para este trabajo de investigación se considera la aplicación del enfoque cuantitativo, ya que los valores o datos obtenidos son procesados c= on el uso de la estadística, medición numérica y conteo para contestar las preguntas que permiten la verificación de la hipótesis planteada. En lo referente al tipo de investigación se puede considerar el presente estudio = como del tipo aplicada; ya que la característica principal es que tiene fines prácticos para actuar, modificar sectores y poder transformar una determina= da zona. El estudio también se considera está dentro del nivel descriptivo ya = que se identificó y se describió las características más importantes de cada microorganismo encontrados en los laboratorios de la Facultad de Ciencias Pecuarias de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Al mencionar el= diseńo de la investigación podemos considerarlo como descriptivo puesto que se identificó y se describió las características importantes de cada microorganismo encontrado.

Resultados

Recolección de muestras

Para el análisis del suelo la muestra se lo hizo de forma sistemática, cada muestra estuvo compuesta por 5 submuestras, aproxim= ándonos a un 80% de precisión. La cantidad de suelo utilizado para análisis de ruti= na es 0.25 kg de suelo, pero es preferible llevar de 0.5 kg a 1kg al laborator= io cabe mencionar que antes de los 30 cm de profundidad aquí es en donde se re= tira la capa de materia orgánica existente (horizonte O) y se tomará el suelo de= la rizosfera (horizonte A) (Chen et al., 2015).

Previo al proceso de siembra y asilamiento de microorganismos; las 5 muestras de suelo recogidas en la fase de campo fuer= on sometidas a un proceso de tamización obteniéndose un total de 10g de cada u= na de las 5 muestras del suelo seleccionadas al azar. Una vez codificadas estas son usadas para la preparación de la primera dilución con agua destilada (10 gramos de muestra de suelo + 90mL de agua destilada), considerándose una dilución madre 10^-1 por cada muestra seleccionada en total 5 diluciones madre (FAO, 2020).

El pH del suelo

De las muestras de suelo de bosques primarios recolectadas fueron seleccionadas 5 muestras al azar; utilizando un total d= e 5 a 10g de cada muestra y diluyéndolas en 15mL agua destilada, procediendo lu= ego al filtrado y la medición del pH con potenciómetro según el método establec= ido por la A.O.A.C (Sociedad Espańola de Microbiología, 2017).

Materia Orgánica

Se debe desecar a unos crisoles para tener un peso constante esto se lo hace en una mufla por unas 6 horas, luego se tamizó 5 muestras fresca de suelo se pesó 5 gramos de cada muestra en una balanza analítica los cuales se los lleva a unos crisoles, se procedió a realizar u= na calcinación por 5 horas removiendo la muestra de suelo cada 20 minutos con = una varilla de agitación, luego se toma el crisol con la muestra de suelo calci= nado en su interior y se la lleva a la mufla a 600°C por 7 horas luego de este tiempo se saca la muestra de la mufla con unas pinzas y se la lleva al desecador hasta que se enfríe, después la cantidad de materia orgánica se la calcula con el peso constante que se anotó del crisol vacío que se lo puso = en la mufla por 6 horas, restándole el peso que nos dio al final luego de haber puesto la muestra de suelo calcinada en el crisol que se lo puso en la mufla por 7 horas.

Cantidad de potasio en el suelo del bosque primari= o

Se tomó una muestra de suelo fresco de 5g por cada muestra de suelo se tamizó se mezcló con 15mL de agua destilada en un matra= z y se lo agitó en un vórtex se lo filtró= con papeles filtro, embudos y matraces luego de 5 horas el agua se filtró por completo se va a retirar y tomar el filtrado se lo colocó en la ce= lda del espectrofotómetro que es de aproximadamente 10mL y a este se le adicion= ó el reactivo de lectura del mineral en nuestro caso el reactivo de potasio que = vino en forma de polvo, se colocó la celda dentro del espectrofotómetro y se procedió a darle inicio para que el equipo haga la lectura al final en la p= antalla nos indicó la cantidad en forma de mg/L es decir miligramos por litros de potasio en la muestra.

Siembra de los microorganismos

Partiendo de las muestras en los tubos de ensayo a partir de la solución madre desde 1x10-1 hasta 1x10-11 se procedió a sembrar por vertido en placa las disoluciones de 1x10-3 1x10-5 1x10-7 y 1x10-9 con 3 repeticiones por cada una de estas y se incuba por 48 horas a 35°C todo este procedimiento es sólo para una muestra de suelo es por ello que este procedimiento se tuvo que repetir con las otras 4 muestras de suelo para estudiar a todas las 5 muestras de microorganismo a obtener en dichas muest= ras de suelo, luego se escogió la UFC/mL más adecuada que se encuentre dentro d= el rango de 10 a 150 (Secretaría de Gobernación Mexicana,1994), debido a que las colonias crecidas no estaban = muy concentradas.

Aislamiento de los microorganismos

Se hace una nueva siembra por vertido en placa en = base a la unidad formadora de colonias (UFC) con las especies que se obtuvieron = de las muestras de suelo, rotuladas como (002), (006), (007), (011), y (012) y= se va a hacer con 2 repeticiones las cuales tienen unas UFC/mL promedio de (4,6 x10^9), (13,3x10^5), (7x10^7), (4,3 x10^9) y (5,3x10^7) respectivamente y se manejó con estos valores en base a la norma oficial mexicana (Secretaría de Gobernación Mexicana,1994), que maneja valores cercanos a 10 UFC/mL como va= lor mínimo este proceso va a ser para los 3 tipos de microrganismos BAL, levadu= ras y bacterias aerobias fermentativas y se hizo la siembra en agar MRS para las BAL en condiciones anaerobias y a un pH entre 4.8 a 5.2 a 37°C por 48 horas, Para las levaduras se hizo en condiciones aerobias en agar Sabouraud un pH = de neutro a 30°C por 48 horas y con un inhibidor de crecimiento bacteriano cloranfenicol en este caso 0,05g/L (FAO, 2020). Para las bacterias aerobias fermentativas se lo hizo en presencia de oxígeno en agar GYC en pH neutro a 30°C por 48 horas. Para este paso a las especies en el caso de las BAL se h= izo una resiembra esta vez por estriado en agar MRS en condiciones anaerobias y= a un pH entre 4.8 a 5.2 a 37°C por 48 horas ya que por lo general estas llega= n a ocupar toda la caja Petri pasada las 48 horas. Para las levaduras se hizo u= na resiembra por estrías en agar YPD (Condalab, 2021), en presencia de oxígeno= pH neutro por 48 horas. Para las bacterias aerobias fermentativas se hizo una resiembra por estrías en presencia de oxígeno en agar GYC en pH neutro a 30= °C por 48 horas, todo este proceso también lleva sus repeticiones como en la siembra primaria y la finalidad es lograr aislar colonias axénicas. Luego de esto se trató de hacer una sel= ección macroscópica en base a las características morfológicas de cada una de las especies de interés a partir de investigaciones anteriores y de bibliografí= a acerca de cada una de las especies a obtener y se hizo una nueva resiembra por estriado en agar MRS en condiciones anaerobias y a un pH entre 4.8 a 5.2 a = 37°C por 48 horas y se aisló 5 especies. Para las levaduras se hizo una resiembra por estrías en agar YPD en presencia de oxígeno pH neutro por 48 horas. Para las bacterias aerobias fermentativas se hizo una resiembra por estrías en presencia de oxígeno en agar GYC en pH neutro a 30°C por 48 horas se tuvo de referencia (Madigan et al., 2015).

Preselección de especies microbiológicas

Se hizo la tinción Gram se pudo ver que todas las 5 especies de las BAL mostraron una coloración violeta y violeta azulado es la característica de la familia de las bacterias ácido-lácticas a excepción de= la primera la muestra (H), para el caso de las bacterias aerobias fermentativa= s se obtuvieron bacterias Gram negativa en 5 especies y en 3 especies se obtuvie= ron bacterias Gram positiva, para las levaduras se utilizó coloración de Wright= .

Luego se hizo la prueba de catalasa y oxidasa a to= das las especies preseleccionadas para poder tener una idea acerca del tipo de microorganismo con el que se pudiera esperar un mejor proceso fermentativo<= o:p>

Degradación de azúcares de BAL

Luego de la purificación se procedió a enriquecer = las muestras que se aisló en agua de peptona, se las dejó por 24 o 48 horas, lu= ego se preparó el caldo rojo fenol con lactosa después se agregó 1mL de la mues= tra enriquecida de las candidatas de BAL y se inoculó dentro de los tubos con el caldo rojo fenol más lactosa estéril su color fue anaranjado al comienzo y = al cabo de 24 o 48 horas se hizo el análisis

Degradación de azúcares de Levaduras

Hecha la purificación de las levaduras en agar YPD= se procedió a enriquecer las muestras que se aisló en agua de peptona, se las = dejó por 24 o 48 horas y se preparó el caldo rojo fenol con dextrosa después se agregó 1mL de la muestra enriquecida de las candidatas de levaduras y se inoculó dentro de los tubos con el caldo rojo fenol más lactosa estéril su color fue anaranjado al inicio y pasado de 24 o 48 horas se hizo el análisis (FutureLearn, 2019).

Degradación de bacterias aerobias fermentativas

Realizada la purificación de las bacterias aerobias fermentativas en agar GYC se procedió a enriquecer las muestras que se aisl= ó en agua de peptona, se las dejó por 24 o 48 horas y se preparó el caldo rojo f= enol con dextrosa después se agregó 1mL de la muestra enriquecida de las candida= tas de levaduras y se inoculó dentro de los tubos con el caldo rojo fenol más lactosa estéril su color fue anaranjado al empezar el análisis y posteriorm= ente de 24 o 48 horas se hizo el análisis y continuará así hasta alcanzar la eta= pa estacionaria (Cerra et al., 2013).

Resistencia al alcohol en Levaduras

Se calculó la cantidad de alcohol y de agua que se utilizó para llegar a la concentración requerida, en la presente investigac= ión se trabajó con concentraciones de alcohol al 8% para elegir la resistencia para lo cual se utilizó la ecuación de C1·V1 =3D C2·V2 por ejemplo se trabajó con 8 muestras, pero se realizó una muestra de más total se trabajó con relación a 9 muestras (90mL) en cada tu= bo de ensayo de 10mL se procedió a hacer el cálculo para concentración de alco= hol al 8% y se utilizó alcohol al 70% y se siguió la ecuación V2=3D [(8%×90mL)/70%]=3D10,29mL de alcohol y luego el cálculo para el agua destil= ada (9"0mL Agua destilada - 10,29mL)=3D79,71mL de agua" destilada fue lo que se utilizó y luego= se le adicionó el agar YPD, a esterilizar sólo se puso el agar disuelto en los 70,71mL del agua destilada, luego de esterilizado se esperó a que la temperatura baje un poco y se le adicionó el alcohol al 70%, esto se debió a que la temperatura de ebullición del etanol está por encima de los 70°C, se incubó a 30°C por 48 horas y se evaluó los resultados

Resistencia al alcohol en bacterias aerobias fermentativas

Se realizó el cálculo de la cantidad de alcohol y = de agua que requirió, en la presente investigación se trabajó con concentracio= nes de alcohol al 8% para elegir la resistencia para lo cual se utilizó la ecua= ción de C1·V1 =3D C2·V2 y luego se preparó con el agar GYC y luego se esperó 24 = o 28 horas para ver los resultados a 30°C

Fermentación de las levaduras en zumo de cítricos<= o:p>

Se realizó un almíbar en proporción 2:1 de azúcar = con agua, 1,5L de almíbar se preparó, y se mezcló con el jugo natural de naranja mezc= lado con mandarina, el zumo de los cítricos tiene que ser de 1,5L luego se mezcl= ó el almíbar con el zumo de los cítricos y se pasteurizó a 80°C por unos 5 a 10 minutos se llenó aproximadamente unos 350mL de la mezcla zumo almíbar en las botellas plásticas por cada una de las muestras de las levaduras aisladas q= ue fueron un total de 8, se tomó una pequeńa muestra para medir su pH y grados brix se tomó 1mL con la micropipeta de la muestra, de las levaduras las cua= les se enriquecieron en un caldo nutritivo 24 horas antes de inocularlo y se lo colocó dentro de las botellas con = el almíbar, se llevó las botellas plásticas inoculadas a una incubadora a unos 30°C y cerradas luego de 24 horas se procedió a verificarlas al igual que e= n la fermentación hecha por levaduras de cerveza (Ferreyra et al., 2009), donde existió actividad biológica en forma de burbujas se procedió a dejar libera= r el gas, en la presente investigación las botellas se las cerró nuevamente, cad= a 2 días se repitió este proceso por 45 días y se evitó que las botellas se que= den con demasiado gas en su interior. La medición de pH se lo hizo cada semana y además se verificó la liberación de CO2

Producción de ácido sulfhídrico<= /span>

Se tomó 1mL de ácido acético glacial y se le adici= onó a 100mL de una solución de acetato de plomo que haya sido preparada al 5% es decir que se ańade una parte de solución del acetato de plomo con una parte= en 5% de volumen y se empapó estas tiras de papel filtro (Instituto Ecuatorian= o de Normalización [INEN], 2012), con esta solución se dejó secar y se hizo sume= rgió en las muestras de zumo de cítricos que fueron inoculadas con los microrganismos se tomó como base (INEN, 2012), y con la ayuda de lo que ind= ica la norma (INEN, 2013).

Identificación de las especies microbiológicas

La identificación de las especies halladas en la presente investigación se las hizo en base a sus características fenotípicas para las bacterias ácido-lácticas se la hizo en relación con las familias (Streptococcus, lactobacillus) como son la morfológica en bacterias, la tolerancia a ph ácido por debajo de 5, el crecimiento en un medio en ausenc= ia de oxígeno, metabolización de la lactosa de la lecha, la fermentación de azúcares, la liberación de gas como subproducto de la respiración celular. = Para las levaduras fermentativas, se las hizo en relación con la familia (Saccharomyces) su morfología la tolerancia a distintas concentraciones de etanol, la degradación de la glucosa y la fructuosa como lo dice Heredia &a= mp; Chiayan (2015), la producción de etanol al estar en un medio con exceso de azúcar, la liberación de CO2 en forma de burbujas la no producción de ácido sulfhídrico. Para hallar bacterias aerobias fermentativas se basó en relaci= ón con las características de la familia de las (Acetobacter) como lo propone Parés & Juárez (2012).

Discusión

pH del suelo

De los datos obtenidos se puede ver que la media d= e pH en dicha zona de bosque tiene un pH de 7.372 con lo que se considera un sue= lo neutro, es por ello que en dicho pH obtenido en la investigación fue muy factible encontrar bacterias, actinomicetos y en mayor medida a microrganis= mos fúngicos, esto se pudo constatar ya que se encontró pocas bacterias ácido lácticas de aproximadamente 5 especies y en cambio para especies fúngicas c= omo levaduras se obtuvo 8 especies cabe mencionar que a medida que el pH es men= or a 7 existe mayor posibilidad de hallar bacterias las cuales sobreviven y gene= ran la descomposición de la materia orgánica y se desarrollan de mejor manera e= n pH un poco ácidos según lo seńala (Center for Agriculture, Food, and Environme= nt, 2018).

Tabla 1=

pH de l= as muestras de suelo del bosque primario

Muestra de suelo

pH

M1=3D002

8,01

M2=3D006

7,65

M3=3D007

7,42

M4=3D011

6,81

M5=3D012

6,97

Materia Orgánica

Como se puede observar en la gráfica de los result= ados obtenidos el porcentaje de materia orgánica es de menos del 1% debido a que= es un bosque primario en la cual es de esperarse que este valor sea bajo si se= lo compara con suelos en donde existe la presencia humana pero a nivel de ser = un suelo silvestre es bastante bueno ronda una media de 0,302 % de materia orgánica en la cual según FAO (2009), es de esperarse esta carga de materia orgánica además de que va a dar un color gris si se la somete al proceso de estudio de materia orgánica por vía seca, con lo cual se pudo verificar que= la tonalidad fue gris en el suelo de estudio en la investigación.

Tabla 2=

Materia orgánica de las muestras de suelo del bosque de Cańi<= /span>

Muestra

Muestra inicial (g)

Muestra final (g)

Materia orgánica (g)

M1(002)

2,076

2,0682

0,0078

M2(006)

2,4732

2,4685

0,0047

M3(007)

2,1988

2,1926

0,0062

M4(011)

2,2575

2,2508

0,0067

M5(012)

2,1847

2,1769

0,0078

Cantidad de potasio en las muestras de suelo<= /o:p>

Se obtuvo 17,518 ppm de potasio con lo cual el valor mencionado este suelo estudiado = se considera un suelo pobre ya que como lo da a conocer Laboratorio Agrolab (2= 017), que los valores se hallan en valores por debajo de 150 ppm son considerados suelos pobres es decir suelos bajos en potasio.

Tabla 3I

Cantida= d de potasio en las muestras del suelo

Muestra

Potasio (mg/L) o (ppm)

M1(002)

20

M2(006)

20

M3(007)

12,23

M4(011)

20

M5(012)

15,36

Fermentación de azúcares hecho por las BAL

Se trabajó con 5 azúcares: lactosa, fructuosa, manitol, glucosa y galactosa las cuales fueron inoculadas junto con las 5 especies aisladas de los microorganismos = del bosque primario de Cańi, en condiciones anaerobias a 35°C por 48 horas, se realiza este tipo de pruebas buscando saber si es que las especies obtenidas pueden llegar a degradarlos azúcares principales pero el glúcido que más importa saber si es que logran metabolizar es la lactosa, ya que esta sería= la principal fuente para producir ácido láctico en el caso de la familia de los lactobacillus.

Tabla 4=

Ferment= ación de los principales azúcares hecho por las BAL<= /p>

Muestra de suelo origen

Código de la especie

Lactosa

Fructuosa

Manitol

Glucosa

Galactosa

(002)

C3R2 (H)

-

+

+

+

-

(006)

C2 (I)

+

-

-

+

+

(007)

C1(J)

+

+

+

+

+

(011)

C3R1 (K)

+

+

+

+

+

(012)

C4 (L)

+

-

-

+

+

Cuando se realizó esta prueba se vio que no todas las especies metabolizaron todos los azúcares a estudiar, pero sí que todas fermentaron la glucosa fue el azúcar= que todas lo pudieron metabolizar al igual que en el estudio de Taye et al. (20= 21), en donde explica que todas las especies de bacterias ácido lácticas (BAL) si utilizan como fuente principal la glucosa estas son homofermentativas en es= ta clasificación se hallan familias como Lactococcus y Streptocccus<= /i> , para las cepas denominada (I) y (K) p= asadas las 24 horas a 32°C fueron las que de mejor manera utilizaron la lactosa co= mo fuente de energía y la pudieron degradar cuando se las observó al microscop= io con el lente de 100X se pudo ver que la forma de estas dos especies era la = (I) en forma de bacilos largos y Gram positivos que si lo comparamos lo que dic= e Parés & Juárez (2012), que la forma en forma de bastones que desprende CO2 corresponde a la familia de los Lactobacillus (p. 76).

Fermentación de las Levaduras

La fermentación realizada por las levaduras se las hizo en zumo de cítricos y al final de 45 días se pudo ver que el pH se red= ujo y todas las muestras fermentaron prueba de ello fue la liberación de CO2

Tabla 5=

Ferment= ación de las levaduras luego de 45 días

El tiempo de fermentación de 45 días

Nombre Código

Lib= eración de CO₂

Lib= eración de H₂S

pH Inicio

pH Final

001AC2

+

-

7

5,9

001BC2

+

-

7

5,4

001BC1

+

-

7

5,42

009C2

+

-

7

5,6

003C1A

+

-

7

5,9

006C1´

+

-

7

6

006C1

+

-

7

6

007C1´

+

-

7

6,1

=

Fermentación de bacterias aerobias fermentativas

La fermentación de las bacterias aerobias fermentativas se la pudo comprobar por la liberación de CO₂ una = baja en el pH además de la comprobación de la liberación de H₂S<= /o:p>

Tabla 6=

Ferment= ación de las l bacterias aerobias fermentativas s luego de 45 días=

El tiempo de fermentación de un mes y medio

Nom= bre Código

Lib= eración de CO₂

Lib= eración de H₂S

pH Inicio

pH Final

001AC2

+

-

7

5,75

001BC2

+

-

7

6

001BC1

+

-

7

6,2

009C2

+

-

7

6,1

003C1A

+

-

7

5,4

006C1´

+

-

7

6,2

006C1

+

-

7

6,3

007C1´

+

-

7

6,2

Identificación de los microorganismos de interés agroindustrial

Se pudo identificar las BAL porque en el estudio las especies halladas todas fermentaron y metabolizaron la glucosa fue el azúcar que todas lo pudieron metabolizar al igual que en el estudio de Taye et al. (2021), en donde expl= ica que todas las especies de bacterias ácido lácticas (BAL) si utilizan como fuente principal la glucosa estas son homofermentativas en esta clasificaci= ón se hallan familias como Lactococcus y Streptocccus es por ello que se podría hablar de que en nuestra investigación también hubo especies denominada (I)= y (K) pasadas las 24 horas a 32°C fueron las que de mejor manera utilizaron la lactosa como fuente de energía y la pudieron degradar cuando se las observó= al microscopio con el lente de 100X se pudo ver que la forma de estas dos espe= cies era la (I) en forma de bacilos largos y Gram positivos y la muestra K y est= as dos coinciden con lo que dice la investigación Parés & Juárez (2012), q= ue la forma en forma de bastones que desprende CO2 corresponde a la familia de= los lactobacillus (p. 76).

Por otra parte, se pudo determinar en la presente investigación que ninguna de las especies de levaduras no logró degradar la lactosa y esto se debe a que el proceso de glucólisis lo realiza de mejor manera con moléculas de glucosa o componentes de ella si se la compara con los análisis de Gilces et al. (2006), en la cual coinci= de los azúcares a fermentar por parte de las levaduras en la cual se utilizó fructuosa, sacarosa, y glucosa obteniendo resultados positivos al igual que= en la investigación de Heredia & Chiayan (2015).

Figura 1<= o:p>

Resultados del proceso de fermentación en zumo de cítricos

Finalment= e, para la identificación de bacterias aerobias fermentativas se vio que todas ellas fermentaron y en la tinción de Gram dieron 5 especies fueron Gram negativas y 3 fueron Gram positivas por lo que a las 5 bacterias que fueron Gram negativas se la puede catalogar como parte de la familia de las Acetobacter ya que dichas características coinciden con las mostradas por P= arés & Juárez (2012).

Conclusiones<= /b>

·&nb= sp; Se analizó las características físicas, químicas d= el suelo y se pudo y en base a los valores que obtuvimos un pH de media de 7,3= 72 con lo que nos dice que es un suelo bastante equilibrado dentro de la categ= oría de suelos neutros, pero también se vio algunas muestras con pH de valor de = 6,81 y 6,97 que les da la categoría de suelos ácidos, se obtuvo las muestras es = una zona muy lluviosa y el nitrógeno continuamente va siendo arrastrado hacia l= as zonas más bajas, el nivel de potasio (K) también es muy bajo de 17,518 ppm = si se lo compara con suelos cultivables, y la materia orgánica arrojó resultad= os de 0,32 que también es muy baja por lo que es un suelo pobre en materia orgánica.

· &nb= sp; Se caracterizaron a los microorganismos especialme= nte bacterias ácido-lácticas de las cuales sólo dos especies aisladas fermentar= on la lactosa con mucha facilidad la C3R2 y la muestra C3R1 las cuales metabolizaron la lactosa muy rápido en las levaduras. La muestra 001 BC1 fu= e la que pudo generar mayor producción de gas y pasó la prueba del SH2 con lo qu= e no es nocivo para su uso para degradar biomasa, en bacterias fermentativas las muestras 009C2 y 007C1´ fueron las que sobrevivieron al alcohol y las que fermentaron de mejor manera y en la prueba de SH2 se presentaron resultados negativos con lo cual también se puede inferir que no afecta al uso humano, finalmente las levaduras aisladas luego de 45 días metabolizando el zumo de= los cítricos con la liberación de etanol siendo una fermentación de interés agroindustrial.

Conflicto de intereses

Los autores deben declarar si existe o no conflict= o de intereses en relación con el artículo presentado.

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El artículo que se publica es de exclusiva responsabilidad de los autores y no necesariamente reflejan el pensamiento = de la Revista Conciencia Digital.

&nbs= p;

El artículo queda en propiedad de la revista y, por tanto, su publicación parcial y/o total en otro medio tiene que ser autoriz= ado por el director de la Revista Conc= iencia Digital.

= ¹=	Alejan= dro Guillermo Orellana Quinchuela	<= /span>	https://orcid.org/0009-0003-3067-6765
	Investigador independiente, Riobamba, Ecuador.
= ²=	María Verónica González Cabrera		https://orcid.org/0000-0002-5358-798X
<= /span>	Facultad de Ciencias Pecuarias, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo (ESPOCH= ), Riobamba, Ecuador. mariav.gonzalez@espoch.edu.ec
= ³=	Carmen Alicia Zavala Tocano=		https://orcid.org/0000-0003-0720-3479
<= /span>	Facultad de Ciencias Pecuarias, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo (ESPOCH= ), Riobamba, Ecuador. alicia.zaval@espoch.edu.ec
= ⁴=	Gabrie= la Margarita Vayas Castillo		https://orcid.org/0000-0001-5402-740X
<= /span>	Ciencias Pecuarias, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo (ESPOCH), Riobamba, Ecuador. gabriela.vayas@espoch.edu.ec=

	Artículo de Investigación Científica y Tecnológica Enviado: 09/02/2023= Revisado: 17/03/2023 Aceptado: 12/04/2023 Publicado:30/05/2023 DOI: https://doi.org/10.33262/concienciadigital.v6i2.1= .2563 <= /o:p>
	=
Cítese:		Orellana Quinchuela, A. G., González Cabrera, M. V., Zavala Tocano, C. A., & Vayas Castillo, G. M. (2023). Aislamiento e identificación de microorganismos con interés agroindustrial a partir de muestras de suelo de bosques primarios del can= tón Colta. ConcienciaDigital, 6(2.1), 24-40. https://doi.org/10.33262/concienciadigital.v6i2.1.2563
		CONCIENCIA DIGITAL, es una revista multidisciplinar, trimestral,<= /b> que se publicará en soporte electrónico tiene como misión contribu= ir a la formación de profesionales competentes con visión humaníst= ica y crítica que sean capaces de exponer sus resultados investigativos y científicos en la misma medida que se promueva mediante su intervención cambios positivos en la sociedad. https://concienciadigital.org La revista es editada por la Editorial Ciencia Digital (Editorial de prestigio registrada en la Cámara Ecuatoriana de Li= bro con No de Afiliación 663) www.celibro.org.ec =
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Palabras claves:= Aerobio, Anaerobiosis, UFC, lactosa, fructuosa		Resumen = Introducción: Los bosques primarios mantienen zonas vírgenes en las cuales existe mucha diversidad biológica aún desconocidas= . Objetivo: El presente estudio tiene la finalid= ad de aislar especies no conocidas de bacterias ácido-lácticas (BAL), levadu= ras fermentativas y bacterias aerobias fermentativas de suelos de bosques primarios, para verificar su potencial uso en la agroindustria. Metodología. para el caso= de bacterias ácido-lácticas se sembró a partir de las muestras de suelo del bosque primario de Cańi en medio ácido con MRS y anaerobiosis con = 13,3 x10^= 5 UFC/mL presentes a 3= 5°C, las especies aisladas degradaron la lactosa y acidificaron el sustrato. En las levaduras se sembró a partir de las muestras del suelo usando 12 x10^5 UFC/mL presentes, en medio YPD neutro con presencia de dextrosa en presen= cia de oxígeno y un inhibidor de crecimiento bacteriano a 30°C, luego se seleccionó las especies resistentes al alcohol al 8%, fermentaron la gluc= osa y fructuosa de buena manera menos la lactosa y se realizó una fermentació= n en jugo de cítricos por 45 días eliminando agentes patógenos y se obtuvo producción de etanol y CO₂.Las bacterias fermentativas se las sembró a partir de las muestras del suelo del bosque primario con 12 x10^5 UFC/mL presentes, en agar de GYC en condiciones aerobias a 30°C. Resultados. Se caracterizaron a los microorganismos especialmente bacterias ácido-láctic= as de las cuales sólo dos especies aisladas fermentaron la lactosa con mucha facilidad la C3R2 y la muestra C3R1 las cuales metabolizaron la lactosa m= uy rápido en las levaduras. La muestra 001 BC1 fue la que pudo generar mayor producción de gas y pasó la prueba del SH₂ con lo que no es no= civo para su uso para degradar biomasa, en bacterias fermentativas las muestras 009C2 y 007C1´ fueron las que sobrevivieron al alcohol y las que fermenta= ron de mejor manera y en la prueba de SH₂ se presentaron resultados negativos con lo cual también se puede inferir que no afecta al uso human= o, finalmente las levaduras aisladas luego de 45 días metabolizando el zumo = de los cítricos con la liberación de etanol siendo una fermentación de inter= és agroindustrial. <= b>Conclusión. Con este trabajo se obtienen bacterias ácido-lácticas aisladas de suelo de bosques primarios con capacidades fermentativas fren= te a la lactosa además de su posible aplicación para degradar biomasa, finalme= nte las levaduras aisladas metabolizan el zumo de los cítricos con la liberac= ión de etanol siendo una fermentación de interés agroindustrial. Ár= ea de estudio general: Agroindustria. Área de estudio específica: Microbiología Industrial. &= nbsp;
Keywords:= Aerobic, Anaerobic, CFU, lactose, fructose		Abstract<= /o:p> Introduction: Primary forests maintain virgin areas in which there is much unknown biological diversity. Objective: The purpose of this study is to isolate unkn= own species of lactic acid bacteria (LAB), fermentative yeasts, and aerobic fermentative bacteria from primary forest soils, to verify their potential use in agroindustry. Methodology. In the case of lactic acid bacte= ria, soil samples from the primary forest of Cańi were planted in an acid medi= um with MRS and anaerobiosis with 13.3 x10^5 CFU/mL present at 35°C, the isolated species degraded the lactose and acidified the substrate. Yeasts were sown from soil samples using 12 x10^5 CFU/mL present, in a neutral Y= PD medium with the presence of dextrose in the presence of oxygen and a bacterial growth inhibitor at 30°C, then the species were selected. resis= tant to 8% alcohol, glucose and fructose fermented well except lactose and fermentation was conducted in citrus juice for 45 days, eliminating patho= gens and ethanol and CO2 production was obtained. Fermentative bacteria were planted from of primary forest soil samples with 12 x10^5 CFU/mL present,= on GYC agar under aerobic conditions at 30°C. Results. The microorganisms, especially lactic acid bacteria, of which only two isolat= ed species fermented lactose very easily, C3R2 and the sample C3R1, which metabolized lactose very quickly in yeasts, were characterized. Sample 001 BC1 was the one that could generate the greatest gas production and passed the SH2 test, which is not harmful for its use to degrade biomass. In fer= mentative bacteria, samples 009C2 and 007C1' were the ones that survived alcohol and those that they fermented in a better way and in the SH2 test negative results were presented, with which it can also be inferred that it does n= ot affect human use, finally the yeasts isolated after 45 days metabolizing = the citrus juice with the release of ethanol being a fermentation of agro-industrial interest. Conclusion. With this work, lactic acid bacteria isolated from the soil of primary forests with fermentative capa= cities against lactose are obtained, in addition to their application to degrade biomass. Finally, the isolated yeasts metabolize the citrus juice with the release of ethanol, being a fermentation of agro-industrial interest=

Muestra de suelo	pH
M1=3D002	8,01
M2=3D006	7,65
M3=3D007	7,42
M4=3D011	6,81
M5=3D012	6,97

Muestra	Muestra inicial (g)	Muestra final (g)	Materia orgánica (g)
M1(002)	2,076	2,0682	0,0078
M2(006)	2,4732	2,4685	0,0047
M3(007)	2,1988	2,1926	0,0062
M4(011)	2,2575	2,2508	0,0067
M5(012)	2,1847	2,1769	0,0078

Muestra	Potasio (mg/L) o (ppm)
M1(002)	20
M2(006)	20
M3(007)	12,23
M4(011)	20
M5(012)	15,36

Muestra de suelo origen	Código de la especie	Lactosa	Fructuosa	Manitol	Glucosa	Galactosa
(002)	C3R2 (H)	-	+	+	+	-
(006)	C2 (I)	+	-	-	+	+
(007)	C1(J)	+	+	+	+	+
(011)	C3R1 (K)	+	+	+	+	+
(012)	C4 (L)	+	-	-	+	+

			El tiempo de fermentación de 45 días
Nombre Código	Lib= eración de CO₂	Lib= eración de H₂S	pH Inicio	pH Final
001AC2	+	-	7	5,9
001BC2	+	-	7	5,4
001BC1	+	-	7	5,42
009C2	+	-	7	5,6
003C1A	+	-	7	5,9
006C1´	+	-	7	6
006C1	+	-	7	6
007C1´	+	-	7	6,1

			El tiempo de fermentación de un mes y medio
Nom= bre Código	Lib= eración de CO₂	Lib= eración de H₂S	pH Inicio	pH Final
001AC2	+	-	7	5,75
001BC2	+	-	7	6
001BC1	+	-	7	6,2
009C2	+	-	7	6,1
003C1A	+	-	7	5,4
006C1´	+	-	7	6,2
006C1	+	-	7	6,3
007C1´	+	-	7	6,2